Assassin's Creed: Brotherhood — akční adventura z pohledu třetí osoby. Hlavními rysy místního gameplay jsou parkour, "schovávání" v davu, tiché vraždy a efektní soubojové scény. Bojový systém byl v porovnání s předchozími díly mírně vylepšen, navíc byl poprvé do série zařazen multiplayerový režim.
Příběh hry se odehrává ve Věčném městě (Římě), které se proměnilo v ruiny během vlády klanu Borgiů, když templáři okrádali zemi a soustředili veškeré bohatství kolem Vatikánu. Musíte zničit všechny věže Borgiů, abyste osvobodili Řím od vlivu této rodiny. Dokončení této mise otevře hráči nové možnosti.
Řím je největším městem v historii série Assassin’s Creed. Je rozdělen na pět oblastí: Vatikán, centrum města, Tiber, Staré město a předměstí. Na rozdíl od předchozích her není potřeba cestovat z města do města, protože veškeré dění hry se odehrává v jednom městě. Místo toho městský tunelový systém umožňuje hráči poměrně snadno se pohybovat mezi různými sektorami města. Hráči mohou prozkoumat celý Řím, stejně jako navštívit část Navarry (Španělsko) a Monteriggioni.
Ve Brotherhood vývojáři představili také nový systém managementu: nyní si hráč může najímat nové rekruty k likvidaci jedné z 15 věží Borgiů rozmístěných po Římě. Hlavním úkolem je zachránit obyvatele města před terorizujícími strážemi. Najatí členové týmu mohou být poslání na mise po Evropě nebo vyžádáni na pomoc během misí. Plněním úkolů získávají assassini zkušenosti. Hráč může také měnit jejich vzhled, dovednosti a schopnost ovládat zbraně, přičemž za to utrácí body získané v boji.
Také v Brotherhood se můžete věnovat vynálezům. Například vytvořit padák Leonarda da Vinciho, který lze použít k seskokům z vysokých budov. Nebo vynalézt jedovaté šípy, luk, rychle působící jed, nebo vytrénovat postavy, aby mohly používat a házet těžší zbraně.