असैसिन्स क्रीड: ब्रदरहुड — तीसरे व्यक्ति का रोमांचक खेल है। स्थानीय गेमप्ले की मुख्य विशेषताएँ हैं: पारकौर, जन-समूह में छिपना, चुपचाप हत्या करना और प्रभावशाली हाथ से हाथ की लड़ाइयाँ। मुकाबला प्रणाली को पिछले भागों की तुलना में कुछ सुधार किया गया है, साथ ही इस श्रृंखला में पहली बार एक मल्टीप्लेयर मोड को भी शामिल किया गया है।
खेल की कहानी स्थायी शहर (रोम) में फैली हुई है, जो कि बोरजिया कबीले के शासनकाल में खंडहर बन गया था, जब ताम्पलियर्स ने देश को लूट लिया, सभी धन को वेटिकन के चारों ओर संकेंद्रित कर दिया। आपको बोरजिया की सभी टावर्स को नष्ट करना होगा ताकि रोम को उसके परिवार के प्रभाव से मुक्त किया जा सके। इस मिशन को पूरा करने पर खिलाड़ी के सामने नई संभावनाएँ खुलती हैं।
रोम असैसिन्स क्रीड श्रृंखला का सबसे बड़ा शहर है। इसे पाँच क्षेत्रों में विभाजित किया गया है: वेटिकन, शहर का केंद्र, टाइबर, पुराना शहर और उपनगर। पिछले खेलों के विपरीत, शहर से शहर यात्रा करने की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि खेल की सभी क्रियाएँ एक ही शहर में होती हैं। इसके बजाय, शहर की सुरंग प्रणाली खिलाड़ी को शहर के विभिन्न क्षेत्रों में काफी आसानी से घूमने की अनुमति देती है। खिलाड़ी पूरे रोम की खोज कर सकते हैं, साथ ही नवारा (स्पेन) और मोन्टेरिज़ियोनी के एक हिस्से को भी देख सकते हैं।
ब्रदरहुड में, डेवलपर्स ने एक नई प्रबंधन प्रणाली भी पेश की है: अब खिलाड़ी स्वयं बोरजिया के 15 टावरों में से एक को नष्ट करने के लिए नए भर्तियों को नियुक्त कर सकता है जो रोम के चारों ओर स्थित हैं। मुख्य कार्य है शहर के निवासियों को आतंकित करने वाले गार्डों से बचाना। खिलाड़ी द्वारा नियुक्त टीम के सदस्यों को वह यूरोप में कार्यों पर भेज सकता है या मिशनों के दौरान मदद के लिए बुला सकता है। कार्यों को पूरा करके, असैसिन्स अनुभव प्राप्त करते हैं। खिलाड़ी उनके रूप, कौशल और हथियारों के उपयोग में सुधार कर सकता है, इसके लिए उसे लड़ाई में अर्जित अंक खर्च करने होते हैं।
ब्रदरहुड में, आप आविष्कारों में भी खुद को समर्पित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, आप लियोनार्डो दा विंची का पैराशूट बना सकते हैं, जिसका उपयोग आप ऊँची इमारतों से कूदने के लिए कर सकते हैं। या जहर लगे तीर, धनुष, त्वरित जहर आविष्कार कर सकते हैं, या पात्रों को प्रशिक्षित कर सकते हैं ताकि वे भारी हथियार रख सकें और फेंक सकें।