Assassin's Creed: Brotherhood — un jeu d'aventure à la troisième personne. Les principales caractéristiques du gameplay local sont le parkour, les « cachettes » dans la foule, les assassinats silencieux, et les combats au corps à corps époustouflants. Le système de combat a été quelque peu amélioré par rapport aux précédents volets, et pour la première fois dans la série, un mode multijoueur a été intégré au jeu.
L'intrigue du jeu se déroule dans la Ville Éternelle (Rome), devenue ruine sous le règne du clan des Borgia, lorsque les templiers pillaient le pays en concentrant toute la richesse autour du Vatican. Vous devez détruire toutes les tours des Borgia pour libérer Rome de l'influence de sa famille. L'achèvement de cette mission ouvre de nouvelles possibilités pour le joueur.
Rome est la plus grande ville de l'histoire de la série Assassin's Creed. Elle est divisée en cinq zones : le Vatican, le centre-ville, le Tibre, la vieille ville, et les banlieues. Contrairement aux jeux précédents, il n'est pas nécessaire de voyager de ville en ville, car toute l'action du jeu se déroule dans une seule ville. Au lieu de cela, le système de tunnels urbains permet au joueur de se déplacer assez facilement entre les différents secteurs de la ville. Les joueurs peuvent explorer tout Rome, ainsi qu'une partie de Navarre (Espagne) et Monteriggioni.
Dans Brotherhood, les développeurs ont également introduit un nouveau système de gestion : désormais, le joueur peut recruter lui-même de nouvelles recrues pour détruire l'une des 15 tours des Borgia situées autour de Rome. L'objectif principal est de sauver les habitants de la ville des gardiens qui les terrorisent. Les membres de l'équipe recrutés peuvent être envoyés en missions à travers l'Europe ou appelés à l'aide pendant les missions. En accomplissant des missions, les assassins gagnent de l'expérience. Le joueur peut également modifier leur apparence, leurs compétences et leur maîtrise des armes en dépensant des points obtenus au combat.
De plus, dans Brotherhood, vous pouvez vous consacrer à des inventions. Par exemple, créer le parachute de Léonard de Vinci, qui pourra être utilisé pour des sauts depuis des bâtiments élevés. Ou inventer des flèches empoisonnées, un arc, du poison à action rapide, ou entraîner des personnages pour qu'ils puissent porter et lancer des armes plus lourdes.