Assassin's Creed: Brotherhood — trò chơi hành động phiêu lưu góc nhìn thứ ba. Những đặc điểm chính của lối chơi địa phương bao gồm parkour, 'trốn tìm' trong đám đông, ám sát lén lút và các trận đấu tay đôi đẹp mắt. Hệ thống chiến đấu đã được cải thiện so với các phần trước, cùng với việc lần đầu tiên trong series, chế độ chơi nhiều người đã được đưa vào game.
Cốt truyện của trò chơi diễn ra ở thành phố Vĩnh cửu (Rome), đã trở thành đống đổ nát trong thời kỳ cai trị của gia đình Borgia, khi các hiệp sĩ dòng Templar đã cướp bóc đất nước, tập trung tất cả tài sản xung quanh Vatican. Bạn phải tiêu diệt tất cả các tháp Borgia để giải phóng Rome khỏi ảnh hưởng của gia đình họ. Việc hoàn thành nhiệm vụ này mở ra những cơ hội mới cho người chơi.
Rome là thành phố lớn nhất trong lịch sử của series Assassin’s Creed. Nó được chia thành năm khu vực: Vatican, trung tâm thành phố, sông Tiber, thành phố cổ và vùng ngoại ô. Khác với các trò chơi trước, việc di chuyển từ thành phố này sang thành phố khác là không cần thiết, vì mọi hành động của trò chơi diễn ra trong một thành phố. Thay vào đó, hệ thống đường hầm thành phố cho phép người chơi dễ dàng di chuyển qua các khu vực khác nhau của thành phố. Người chơi có thể khám phá toàn bộ Rome, cũng như xem một phần của Navarra (Tây Ban Nha) và Monteriggioni.
Trong Brotherhood, các nhà phát triển cũng giới thiệu một hệ thống quản lý mới: giờ đây người chơi có thể tự mình tuyển dụng những người mới để tiêu diệt một trong 15 tháp Borgia nằm rải rác quanh Rome. Nhiệm vụ chính là cứu những cư dân của thành phố khỏi những lính canh đang khủng bố họ. Các thành viên được tuyển dụng có thể được người chơi gửi đi thực hiện nhiệm vụ ở châu Âu hoặc gọi họ đến hỗ trợ trong các nhiệm vụ. Bằng cách thực hiện các nhiệm vụ, các sát thủ sẽ tích lũy kinh nghiệm. Người chơi cũng có thể thay đổi diện mạo, kỹ năng và khả năng cầm vũ khí của họ, tiêu tốn điểm kiếm được trong các trận chiến.
Cũng trong Brotherhood, bạn có thể dành thời gian cho việc phát minh. Ví dụ, tạo ra chiếc dù của Leonardo da Vinci, có thể sử dụng để nhảy từ các tòa nhà cao. Hoặc phát minh ra những mũi tên có độc, cung, thuốc độc hoạt động nhanh, hoặc huấn luyện nhân vật để họ có thể cầm và ném những vũ khí nặng hơn.