Assassin's Creed: Brotherhood — un gioco d'avventura in terza persona. Le principali caratteristiche del gameplay locale includono parkour, "nascondersi" tra la folla, omicidi silenziosi e spettacolari combattimenti corpo a corpo. Il sistema di combattimento è stato migliorato rispetto ai capitoli precedenti e, per la prima volta nella serie, è stata inclusa una modalità multiplayer.
La trama del gioco si svolge nella Città Eterna (Roma), ridotta in rovine durante il dominio del clan Borgia, quando i templari saccheggiavano il paese, concentrando tutta la ricchezza attorno al Vaticano. Devi distruggere tutte le torri dei Borgia per liberare Roma dall'influenza della loro famiglia. Completare questa missione apre nuove opportunità per il giocatore.
Roma è la città più grande nella storia della serie Assassin’s Creed. È suddivisa in cinque aree: Vaticano, centro città, Tevere, Città Vecchia e sobborghi. A differenza dei giochi precedenti, non è necessario viaggiare da città a città, poiché tutta l'azione del gioco si svolge in una sola città. Invece, il sistema di tunnel della città consente al giocatore di spostarsi facilmente tra i diversi settori. I giocatori possono esplorare tutta Roma e vedere anche parte della Navarra (Spagna) e Monteriggioni.
In Brotherhood, gli sviluppatori hanno introdotto anche un nuovo sistema di gestione: ora il giocatore può assumere nuovi reclute per distruggere una delle 15 torri dei Borgia situate attorno a Roma. L'obiettivo principale è salvare gli abitanti della città dai guardiani che li terrorizzano. I membri della squadra assunti possono essere inviati in missioni in Europa o chiamati in aiuto durante le missioni. Completando le missioni, gli assassini guadagnano esperienza. Il giocatore può anche modificare il loro aspetto, abilità e competenza nel maneggiare armi, spendendo i punti guadagnati in combattimento.
In Brotherhood puoi anche dedicarti alle invenzioni. Ad esempio, creare il paracadute di Leonardo Da Vinci, che può essere utilizzato per tuffarsi da edifici alti. Oppure inventare frecce avvelenate, un arco, veleno a rapida azione o addestrare personaggi per maneggiare e lanciare armi più pesanti.