Assassin's Creed: Brotherhood — μια περιπετειώδης παιχνίδι τρίτου προσώπου. Τα κύρια χαρακτηριστικά του τοπικού gameplay περιλαμβάνουν τον παρκούρ, την "κρυψώνα" στον όχλο, τις σιωπηλές δολοφονίες και τις εντυπωσιακές κοντινές μάχες. Το σύστημα μάχης έχει βελτιωθεί σε σύγκριση με προηγούμενους τίτλους, ενώ για πρώτη φορά στη σειρά, το παιχνίδι περιλαμβάνει έναν multiplayer τρόπο παιχνιδιού.
Η πλοκή του παιχνιδιού διαδραματίζεται στην Αιώνια Πόλη (Ρώμη), η οποία έχει μετατραπεί σε ερείπια κατά την διακυβέρνηση του κλάδου των Μπορτζία, όταν οι ναΐτες λεηλατούσαν τη χώρα, συγκεντρώνοντας όλο τον πλούτο γύρω από το Βατικανό. Πρέπει να καταστρέψετε όλους τους πύργους των Μπορτζία για να απελευθερώσετε τη Ρώμη από την επιρροή της οικογένειάς τους. Η ολοκλήρωση αυτής της αποστολής ανοίγει νέες δυνατότητες για τον παίκτη.
Η Ρώμη είναι η μεγαλύτερη πόλη στην ιστορία της σειράς Assassin’s Creed. Είναι χωρισμένη σε πέντε περιοχές: Βατικανό, κέντρο της πόλης, Τίβερη, Παλαιά Πόλη και προάστια. Σε αντίθεση με προηγούμενους τίτλους, δεν απαιτείται ταξίδι από πόλη σε πόλη, καθώς όλη η δράση του παιχνιδιού λαμβάνει χώρα σε μία πόλη. Αντίθετα, το αστικό σωληνωτό σύστημα επιτρέπει στον παίκτη να μετακινείται αρκετά εύκολα σε διάφορους τομείς της πόλης. Οι παίκτες μπορούν να εξερευνήσουν ολόκληρη τη Ρώμη, καθώς και να δουν ένα τμήμα της Ναβάρας (Ισπανία) και του Μοντεριτζόνι.
Στο Brotherhood, οι προγραμματιστές παρουσίασαν επίσης ένα νέο σύστημα διαχείρισης: τώρα ο παίκτης μπορεί να προσλάβει νέους рекруτούς για να καταστρέψει έναν από τους 15 πύργους των Μπορτζία που βρίσκονται γύρω από τη Ρώμη. Η κύρια αποστολή είναι να σώσουν τους κατοίκους της πόλης από τους τρομοκρατημένους φύλακες. Τα προσλαμβανόμενα μέλη της ομάδας μπορούν να αποσταλούν σε αποστολές στην Ευρώπη ή να κληθούν για βοήθεια κατά τη διάρκεια των αποστολών. Εκτελώντας αποστολές, οι ασσασίνες κερδίζουν εμπειρία. Ο παίκτης μπορεί επίσης να αλλάξει την εμφάνιση, τις δεξιότητες και την ικανότητα χειρισμού όπλων των χαρακτήρων, ξοδεύοντας γι' αυτό τα πόντους που αποκτούν σε μάχες.
Επίσης στο Brotherhood, μπορείτε να αφιερωθείτε σε εφευρέσεις. Για παράδειγμα, μπορείτε να δημιουργήσετε το αλεξίπτωτο του Λεονάρντο ντα Βίντσι, το οποίο θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για άλματα από ψηλά κτίρια. Ή να εφεύρετε δηλητηριωμένα βέλη, τόξα, γρήγορη δηλητηρίαση, ή να εκπαιδεύσετε χαρακτήρες ώστε να μπορούν να κρατούν και να πετάνε πιο βαριά όπλα.