Assassin's Creed: Brotherhood — permainan petualangan orang ketiga. Fitur utama dari gameplay lokal adalah parkour, 'sembunyi-sembunyi' di kerumunan, pembunuhan diam-diam, dan pertarungan tangan kosong yang menakjubkan. Sistem pertarungan telah sedikit ditingkatkan dibandingkan dengan bagian sebelumnya, ditambah untuk pertama kalinya dalam seri, mode multiplayer telah dimasukkan ke dalam permainan.
Cerita permainan berlangsung di Kota Abadi (Roma), yang telah berubah menjadi reruntuhan selama pemerintahan klan Borgia, ketika para Templar merampok negara tersebut, mengumpulkan semua kekayaan di sekitar Vatikan. Anda harus menghancurkan semua menara Borgia untuk membebaskan Roma dari pengaruh keluarganya. Menyelesaikan misi ini membuka peluang baru bagi pemain.
Roma adalah kota terbesar dalam sejarah seri Assassin’s Creed. Kota ini dibagi menjadi lima wilayah: Vatikan, pusat kota, Tiber, Kota Tua, dan pinggiran kota. Berbeda dengan permainan sebelumnya, tidak perlu melakukan perjalanan dari kota ke kota karena semua aksi permainan terjadi di satu kota. Sebagai gantinya, sistem terowongan kota memungkinkan pemain untuk bergerak cukup mudah di berbagai sektor kota. Pemain dapat menjelajahi seluruh Roma, serta melihat sebagian dari Navarra (Spanyol) dan Monteriggioni.
Di Brotherhood, para pengembang juga memperkenalkan sistem manajemen baru: sekarang pemain dapat merekrut anggota baru untuk menghancurkan salah satu dari 15 menara Borgia yang terletak di sekitar Roma. Tugas utama adalah menyelamatkan penduduk kota dari penjaga yang meneror mereka. Anggota tim yang direkrut dapat dikirim dalam misi di Eropa atau dipanggil untuk membantu selama misi. Dengan menyelesaikan misi, para pembunuh mendapatkan pengalaman. Pemain juga dapat mengubah penampilan, keterampilan, dan kemampuan menggunakan senjata karakter, dengan menghabiskan poin yang diperoleh dalam pertempuran.
Di Brotherhood, Anda juga dapat mencurahkan diri pada penemuan. Misalnya, menciptakan parasut Leonardo da Vinci yang dapat digunakan untuk melompat dari gedung tinggi. Atau menciptakan anak panah beracun, busur, racun cepat, atau melatih karakter agar mampu membawa dan melempar senjata yang lebih berat.