Assassin's Creed: Brotherhood — egy harmadik személyű kalandjáték. A helyi játékmenet legfontosabb jellemzői a parkour, a tömegben való "bújócska", csendes gyilkosságok és látványos közelharci összecsapások. A harc rendszerét némileg javították a korábbi részekhez képest, ráadásul a sorozatban először bevezették a többjátékos módot.
A játék története az Örök Városban (Róma) játszódik, amely romokká vált a Borgiák klánja alatt, miközben a templomosok kifosztották az országot, összegyűjtve a gazdagságot a Vatikán körül. El kell pusztítanod az összes Borgiak-tornyot, hogy Róma megszabaduljon a család befolyásától. E misszió teljesítése új lehetőségeket nyit meg a játékos előtt.
Róma a legnagyobb város az Assassin's Creed sorozat történetében. Öt területre oszlik: Vatikán, a városközpont, a Tiberis, a Régi Város és a külvárosok. A korábbi játékokkal ellentétben nem szükséges városról városra utazni, mivel a játék eseményei egy városban zajlanak. Ehelyett a városi alagútrendszer lehetővé teszi a játékos számára, hogy viszonylag könnyen közlekedjen a város különböző szektoraiban. A játékosok felfedezhetik egész Rómát, valamint megnézhetik Navarrát (Spanyolország) és Monteriggionit.
A Brotherhood során a fejlesztők egy új menedzsment rendszert is bevezettek: a játékos mostantól saját maga toborozhat új rekrutákat az 15 Borgiak-toronyból egyike elpusztításához, amelyek Róma körül találhatók. A fő feladat az, hogy megmentsd a város lakóit a terrorizáló őröktől. A toborzott csapattagokat a játékos küldheti Európa különböző helyszíneire vagy hívhatja őket segítségül a küldetések során. Az Assassinok tapasztalatot szereznek a küldetések teljesítésekor. A játékos emellett megváltoztathatja a kinézetüket, készségeiket és fegyverhasználati képességeiket, költségek formájában a harcok során szerzett pontokat.
A Brotherhood-ban elkötelezheted magad a találmányok iránt is. Például elkészítheted Leonardo Da Vinci ejtőernyőjét, amelyet magas épületekből való ugrásokhoz használhatsz. Vagy kifejlesztheted a mérgezett nyilakat, a íjat, a gyors hatású mérgét, vagy edzheted a karaktereket, hogy képesek legyenek nehezebb fegyvereket tartani és hajítani.