Assassin's Creed: Brotherhood — przygodowa gra z perspektywy trzeciej osoby. Główne cechy lokalnego gameplayu to parkour, „chowanie się” w tłumie, ciche zabójstwa oraz efektowne walki wręcz. System walki został nieco ulepszony w porównaniu do poprzednich części, a po raz pierwszy w serii w grze pojawił się tryb wieloosobowy.
Fabuła gry rozgrywa się w Wiecznym Mieście (Rzymie), które stało się ruiną podczas rządów klanu Borgiów, kiedy templariusze plądrowali kraj, koncentrując całe bogactwo wokół Watykanu. Musisz zniszczyć wszystkie wieże Borgiów, aby uwolnić Rzym od wpływu tej rodziny. Zakończenie tej misji otwiera nowe możliwości przed graczem.
Rzym jest największym miastem w historii serii Assassin’s Creed. Został podzielony na pięć obszarów: Watykan, centrum miasta, Tyber, Stare Miasto i przedmieścia. W przeciwieństwie do poprzednich gier, podróżowanie z miasta do miasta nie jest wymagane, ponieważ całe działanie gry odbywa się w jednym mieście. Zamiast tego miejska system tuneli umożliwia graczowi stosunkowo łatwe poruszanie się po różnych sektorach miasta. Gracze mogą eksplorować cały Rzym, a także zobaczyć część Nawarry (Hiszpania) i Monteriggioni.
W Brotherhood twórcy wprowadzili także nowy system zarządzania: teraz gracz może sam zatrudniać nowych rekrutek do zniszczenia jednej z 15 wież Borgiów, ulokowanych wokół Rzymu. Główne zadanie — uratować mieszkańców miasta przed terroryzującymi ich strażnikami. Zatrudnionych członków drużyny gracz może wysłać na zadania po Europie lub wezwanie ich na pomoc podczas misji. Wykonując zadania, asasyni zdobywają doświadczenie. Gracz może również zmieniać ich wygląd, umiejętności i zdolność posługiwania się bronią, wydając na to punkty zdobyte w walkach.
W Brotherhood możesz również poświęcić się wynalazkom. Na przykład, stworzyć spadochron Leonardo da Vinci, który będzie można użyć do skoków z wysokich budynków. Lub wynaleźć zatrute strzały, łuk, szybki jad, lub przeszkolić postacie, aby mogły trzymać i rzucać cięższą bronią.