Assassin's Creed: Brotherhood — een avontuurlijke tredje-persoons spel. De belangrijkste kenmerken van de lokale gameplay zijn parkour, "verstoppertje" in de menigte, stille moorden en spectaculaire hand-tot-hand gevechten. Het gevechtssysteem is verbeterd in vergelijking met eerdere delen, en voor het eerst in de serie is er een multiplayer-modus in de game opgenomen.
Het verhaal van het spel speelt zich af in de Eeuwige Stad (Rome), die in puin ligt tijdens het bewind van de Borgia-clan, terwijl de Tempeliers het land plunderden en alle rijkdommen rondom het Vaticaan bijeenbrachten. Je moet alle Borgia-torens vernietigen om Rome te bevrijden van de invloed van zijn familie. Het voltooien van deze missie opent nieuwe mogelijkheden voor de speler.
Rome is de grootste stad in de geschiedenis van de Assassin’s Creed-serie. Het is verdeeld in vijf gebieden: het Vaticaan, het stadscentrum, de Tiber, de Oude Stad en de voorsteden. In tegenstelling tot eerdere games is het niet nodig om van stad naar stad te reizen, aangezien alle actie van de game zich in één stad afspeelt. In plaats daarvan stelt het stedelijke tunnelsysteem de speler in staat om vrij eenvoudig tussen verschillende sectoren van de stad te bewegen. Spelers kunnen heel Rome verkennen, evenals een deel van Navarra (Spanje) en Monteriggioni.
In Brotherhood introduceerden de ontwikkelaars ook een nieuw managementsysteem: nu kan de speler zelf nieuwe rekruten huren om een van de 15 Borgia-torens, gelegen rond Rome, te vernietigen. De hoofdtaak is om de inwoners van de stad te redden van de hen terroriserende bewakers. Huurde teamleden kunnen door Europa op missies worden gestuurd of om hulp worden geroepen tijdens missies. Door missies te voltooien, verdienen de assassinen ervaring. De speler kan ook hun uiterlijk, vaardigheden en wapenspecialisaties aanpassen door de verdiende punten in de strijd te besteden.
In Brotherhood kun je je ook wijden aan uitvindingen. Bijvoorbeeld, het creëren van een parachute van Leonardo Da Vinci, die kan worden gebruikt voor sprongen van hoge gebouwen. Of het uitvinden van vergiftigde pijlen, een boog, snelwerkend vergif, of het trainen van personages zodat ze zwaardere wapens kunnen vasthouden en gooien.