Assassin's Creed: Brotherhood — kolmannen persoonan seikkailupeli. Paikallisen pelimekanismin tärkeimmät ominaisuudet ovat parkour, "piilottelu" vä crowds, hiljaiset murhat ja näyttävät lähitaistelut. Taistelujärjestelmää on parannettu verrattuna aikaisempiin osiin, ja multiplayer-tila on ensimmäistä kertaa mukana sarjassa.
Pelin tarina tapahtuu Ikonisessa kaupungissa (Roomassa), joka on muuttunut raunioiksi Borgia-suvun hallituksen aikana, kun templarit ryöstelivät maata keskittäen kaiken rikkauden Vatikaanin ympärille. Sinun on tuhottava kaikki Borgia-tornit vapauttaaksesi Rooma heidän perheensä vaikutuksesta. Tämän tehtävän suorittaminen avaa uusia mahdollisuuksia pelaajalle.
Rooma on suurin kaupunki Assassin's Creed -sarjassa. Se on jaettu viiteen alueeseen: Vatikaani, kaupungin keskusta, Tiber, vanha kaupunki ja esikaupungit. Aikaisemmista peleistä poiketen kaupungista toiseen matkustaminen ei ole tarpeen, sillä kaikki pelin tapahtumat tapahtuvat yhdessä kaupungissa. Sen sijaan kaupungin tunnelijärjestelmä mahdollistaa pelaajan liikkua melko helposti eri sektoreiden välillä. Pelaajat voivat tutkia koko Roomaa sekä nähdä osan Navarrasta (Espanja) ja Monteriggionista.
Brotherhoodissa kehittäjät esittelivät myös uuden hallintojärjestelmän: nyt pelaaja voi itse palkata uusia rekryyttejä yhden 15 Borgia-tornin tuhoamiseen, jotka sijaitsevat ympäri Roomaa. Pääkohteena on pelastaa kaupungin asukkaat terrorisoivilta vartijoilta. Palkattuja tiimin jäseniä voi lähettää tehtäviin Euroopassa tai kutsua avuksi missioiden aikana. Suorittamalla tehtäviä assassinien kokemuspisteet kasvavat. Pelaaja voi myös muuttaa heidän ulkonäköään, taitojaan ja kykynsä käyttää aseita sijoittamalla taisteluista ansaitsemiaan pisteitä.
Myös Brotherhoodissa voit omistautua keksinnöille. Esimerkiksi voit luoda Leonardo da Vincin laskuvarjon, jota voidaan käyttää hyppyihin korkeista rakennuksista. Tai keksiä myrkyllisiä nuolet, jouset, nopeasti vaikuttavan myrkyn tai kouluttaa hahmoja pitämään ja heittämään painavampia aseita.