Assassin's Creed: Brotherhood — un juego de aventuras en tercera persona. Las principales características de la jugabilidad local son el parkour, el "escondite" en la multitud, los asesinatos silenciosos y los impresionantes combates cuerpo a cuerpo. El sistema de combate se ha mejorado en comparación con las entregas anteriores, y por primera vez en la serie, se incluye un modo multijugador.
La trama del juego se desarrolla en la Ciudad Eterna (Roma), que se ha convertido en ruinas durante el gobierno del clan Borgia, cuando los templarios saquearon el país, concentrando toda la riqueza alrededor del Vaticano. Debes destruir todas las torres Borgia para liberar a Roma de la influencia de su familia. Completar esta misión abre nuevas oportunidades para el jugador.
Roma es la ciudad más grande en la historia de la serie Assassin’s Creed. Está dividida en cinco áreas: el Vaticano, el centro de la ciudad, el Tíber, la Ciudad Antigua y los suburbios. A diferencia de los juegos anteriores, no se requiere viajar de ciudad en ciudad, ya que toda la acción del juego tiene lugar en una sola ciudad. En su lugar, el sistema de túneles de la ciudad permite al jugador moverse con bastante facilidad por diferentes sectores de la ciudad. Los jugadores pueden explorar toda Roma, así como ver parte de Navarra (España) y Monteriggioni.
En Brotherhood, los desarrolladores también introdujeron un nuevo sistema de gestión: ahora el jugador puede reclutar nuevos miembros para destruir una de las 15 torres Borgia ubicadas alrededor de Roma. La tarea principal es salvar a los ciudadanos de los guardianes que los aterrorizan. Los miembros del equipo reclutados pueden ser enviados a misiones por Europa o ser llamados a ayudar durante las misiones. Al completar tareas, los asesinos ganan experiencia. El jugador también puede cambiar su apariencia, habilidades y dominio de armas, gastando los puntos obtenidos en combate.
Además, en Brotherhood puedes dedicarte a las invenciones. Por ejemplo, crear el paracaídas de Leonardo da Vinci, que se puede usar para saltar desde edificios altos. O inventar flechas envenenadas, un arco, veneno de acción rápida, o entrenar personajes para que puedan manejar y lanzar armas más pesadas.