Assassin's Creed: Brotherhood — เกมผจญภัยมุมมองบุคคลที่สาม ฟีเจอร์หลักของเกมในท้องถิ่น ได้แก่ การเคลื่อนไหวแบบปาร์กour, การเล่นซ่อนหาในฝูงชน, การฆ่าที่เงียบสงบ และการต่อสู้แบบประชิดตัวที่ยอดเยี่ยม ระบบการต่อสู้ได้รับการปรับปรุงขึ้นบ้างเมื่อเปรียบเทียบกับภาคก่อน ๆ นอกจากนี้ยังเป็นครั้งแรกในซีรีส์ที่มีโหมดผู้เล่นหลายคนในเกม
เนื้อเรื่องของเกมเกิดขึ้นในเมืองนิรันดร์ (กรุงโรม) ซึ่งกลายเป็นซากเมืองในช่วงการปกครองของตระกูลโบร์จาจ เมื่ออัศวินเทมพลาร์ปล้นประเทศ โดยมุ่งความมั่งคั่งทั้งหมดไปที่รอบวาติกัน คุณต้องทำลายหอคอยโบร์จาทั้งหมดเพื่อปลดปล่อยโรมจากอิทธิพลของครอบครัวนี้ การสำเร็จภารกิจนี้จะเปิดโอกาสใหม่ ๆ ให้กับผู้เล่น
โรมเป็นเมืองที่ใหญ่ที่สุดในประวัติศาสตร์ของซีรีส์ Assassin’s Creed มันถูกแบ่งออกเป็นห้าเขต ได้แก่ วาติกัน, ศูนย์กลางของเมือง, แม่น้ำไทเบอร์, เมืองเก่า และชานเมือง แตกต่างจากเกมก่อน ๆ ผู้เล่นไม่จำเป็นต้องเดินทางจากเมืองหนึ่งไปยังอีกเมืองหนึ่ง เนื่องจากเหตุการณ์ทั้งหมดในเกมเกิดขึ้นในเมืองเดียว แทนที่จะเป็นเช่นนั้น ระบบอุโมงค์ในเมืองช่วยให้ผู้เล่นเดินทางไปยังส่วนต่าง ๆ ของเมืองได้อย่างง่ายดาย ผู้เล่นสามารถสำรวจทั้งกรุงโรม รวมถึงดูบางส่วนของนาวาร์รา (สเปน) และมอนเทอริจอเนีย
ใน Brotherhood ผู้พัฒนาได้นำเสนอระบบการจัดการใหม่: ตอนนี้ผู้เล่นสามารถจ้างสมาชิกใหม่เพื่อทำลายหนึ่งใน 15 หอคอยของโบร์จาที่ตั้งอยู่รอบ ๆ กรุงโรม ภารกิจหลักคือการช่วยเหลือชาวเมืองจากการล่วงละเมิดของยามที่คุกคาม พันธมิตรที่จ้างมาสามารถส่งไปทำภารกิจในยุโรปหรือเรียกมาช่วยในระหว่างภารกิจได้ ขณะทำภารกิจ อัสซาซินจะสะสมประสบการณ์ ผู้เล่นยังสามารถเปลี่ยนลักษณะท่าทาง, ทักษะ และความสามารถในการใช้อาวุธของตัวละครได้ โดยใช้คะแนนที่ได้รับจากการต่อสู้
นอกจากนี้ใน Brotherhood คุณยังสามารถอุทิศตนให้กับการประดิษฐ์ได้ เช่น สร้างร่มชูชีพของเลโอนาร์โด ดา วินชีที่สามารถใช้สำหรับกระโดดจากอาคารสูง หรือประดิษฐ์ลูกธนูพิษ, คันธนู, ยาพิษที่ทำงานอย่างรวดเร็ว หรือฝึกฝนตัวละครให้สามารถถือและขว้างอาวุธที่หนักกว่าได้