Assassin's Creed: Brotherhood — ett äventyrsspel i tredjeperson. De främsta egenskaperna för den lokala spelupplevelsen är parkour, "gömma sig" i folkmassor, tysta mord och imponerande närstrider. Kampsystemet har förbättrats något jämfört med tidigare delar, och för första gången i serien har en flerspelarläge inkluderats.
Spelets handling utspelar sig i den Eviga staden (Rom), som har förvandlats till ruiner under klanen Borgias styre, när tempelriddarna plundrade landet och koncentrerade all rikedom kring Vatikanen. Du måste förstöra alla Borgias torn för att befria Rom från hans familjs inflytande. Att slutföra denna uppdrag öppnar upp nya möjligheter för spelaren.
Rom är den största staden i Assassin’s Creed-seriens historia. Den är indelad i fem områden: Vatikanen, stadens centrum, Tibern, Gamla stan och förorterna. Till skillnad från tidigare spel krävs det inte längre att resa mellan städer, eftersom allt spel äger rum i en och samma stad. Istället gör stadens tunnelsystem det möjligt för spelaren att enkelt förflytta sig mellan olika sektorer av staden. Spelarna kan utforska hela Rom samt se en del av Navarra (Spanien) och Monteriggioni.
I Brotherhood introducerade utvecklarna också ett nytt ledarskapssystem: nu kan spelaren rekrytera nya medlemmar för att förstöra ett av de 15 Borgias torn som ligger runt Rom. Huvuduppgiften är att rädda stadsborna från de terroriserande vakterna. De rekryterade medlemmarna kan skickas ut på uppdrag i Europa eller kallas in för hjälp under uppdrag. Genom att utföra uppdrag får assassinerna erfarenhet. Spelaren kan också ändra deras utseende, färdigheter och vapenhantering genom att använda poäng som de tjänat i strider.
I Brotherhood kan du också ägna dig åt uppfinningar. Till exempel kan du skapa en fallskärm av Leonardo da Vinci som kan användas för hopp från höga byggnader. Eller uppfinna giftiga pilar, en båge, snabbverkande gift, eller träna karaktärer så att de kan hantera och kasta tyngre vapen.